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Fourier Transform Infrared Spectroscopy

電気泳動の基本

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電気泳動の基本

電気泳動(electrophoresis)とは

電気泳動(electrophoresis)は電場をかけて分子を分離する方法のこと。

電場がかかると、電荷と質量の比で決まる速度で分子は移動する。

例えば形状と質量が似たもの同士の分子の場合、正味の電荷の多いものほど電極に向かって速く移動する。

ヌクレオチドやアミノ酸などの小さな分子の分離は電気泳動利用の一例。

この場合には、ろ紙のように水を吸い込みやすい多孔性物質に試料を一滴染み込ませて伝導性の液に浸す。

ろ紙の両端に電圧をかけると、低分子は電荷の大きさに従った速度でろ紙中を移動する。


ゲル電気泳動とは

大きさや形が違うタンパク質や核酸でも、電荷と質量の比は変わらないことが多い。

長さの違うこうした高分子を「溶液中で」電気泳動しても分離はできない。

しかし、ゲル中だと分離がうまくいく。

ゲル(gel)とは水を含んだ半固体のこと。

小さな分子ほどゲル中を移動しやすい。

そのため大きさによって制限酵素断片のように長さの違う分子も分離できる。

ゲル中では拡散が抑制されるので、長さの違う分子はそれぞれバンド状に分かれる。

バンドの幅は、試料を乗せたくぼみの幅に等しい。

アガロースゲル電気泳動

アガロースゲル電気泳動(Agarose Gel Electrophoresis)とは、アガロースのゲルを使用した電気泳動により、核酸を分離する方法のこと。

DNAはマイナスに荷電

DNAやRNAはヌクレオチドあたり、負電荷を持つリン酸基が一つあるので中性付近でも強くマイナスに荷電している。

そのため、電気泳動でDNAやRNA分子は陽極(+)側に泳動される。

電気泳動では小さなものから先に泳動されるので、大きさによって核酸の分離ができる。

サイズマーカーを一緒に泳動することによって、核酸の大きさ(長さ)を確認することも可能。

エチブロ染色とは

臭化エチジウム(EtBr:エチジウムブロマイド)をゲルに加えると、臭化エチジウムがDNAに結合する。

これに紫外線を照射するとDNAに結合した臭化エチジウムが光るので、電気泳動の結果を写真に残すことができるようになる。


ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)

ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis、PAGE)とは、
ポリアクリルアミドのゲルを使用した電気泳動により、タンパク質や核酸を分離する方法のこと。

タンパク質を電気泳動で分離するには、ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)を使うことが多い。

2枚のガラス板の間でアクリルアミド単量体(モノマー)を重合させてポリアクリルアミド鎖を作り、これを架橋してゲルにする。

ゲルにできる孔の大きさはポリアクリルアミドと架橋剤の濃度で調節できる。


PAGEの特徴

ポリアクリルアミドゲル電気泳動の分離能力は極めて高い。

タンパク質混合物をゲルにのせ電流を流すと、小さなタンパク質は大きなものより速くゲル中を移動する。

移動速度はゲルの穴の大きさと電場の強さで決まる。

高度に架橋されたゲルは穴が小さいので、小さなタンパク質やペプチドの分離にはよいが、大きなタンパク質の分離には適さない。


ポリアクリルアミドとは

ポリアクリルアミド(PMA)とは、アクリルアミドが2個以上つながって重合した高分子(ポリマー)のこと。

高分子のポリアクリルアミドには毒性はない。

ポリアクリルアミドは粘度が高いという性質を持ち、電気泳動以外にも様々な分野で利用されています。

PMAの利用例

土木工事などの土壌凝固剤
下水道工事の漏水防止剤
バッテリー容器
写真フィルム


アクリルアミドとは

アクリルアミドはポリアクリルアミドを構成する単量体(モノマー)のこと。

CH2=CH-CONH

エチレンの水素一つが-CONHに代わった分子構造を持つ。
それゆえにエチレンと同じように高分子になりやすい性質を持つ。

見た目:白色結晶粉末
分子量:71
融点:摂氏85度 .

アクリルアミドの毒性

モノマーのアクリルアミドは動物に対して毒性があり、日本では劇物に指定されている。


SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)とは

タンパク質混合物の分離法として最も有効なのが、ゲル電気泳動前と泳動中にタンパク質をイオン性界面活性剤のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)にさらすというものである。

SDS中では、タンパク質が変性する。

多量体タンパク質はサブユニットに解離し、すべてのポリペプチド鎖は似たような電荷‐質量比をもつ長く伸びた構造をとるようになる。

このSDS処理でタンパク質間の形の差が無くなり、質量に比例したポリペプチド鎖の長さだけがゲル中の移動速度を決めることになる。

この方法はSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)と呼ばれており、タンパク質分子は全体として陰性に荷電して陽極方向に移動する。

SDS-PAGEのメリット

分子量が10%程度しか違わないポリペプチド鎖を分離することができる。

既知の分子量を持つタンパク質の移動距離と比較すれば、特定のタンパク質の分子量も推定できる。