FT-IRのお仕事

Fourier Transform Infrared Spectroscopy

HPLC分離の原理

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HPLC分離の原理

吸着・分配クロマト:化学的
. ├順相クロマト
. └逆相クロマト

サイズ排除クロマト:物理的

イオン交換クロマト:電気化学的

アフィニティクロマト:免疫的

吸着クロマトグラフィー

固体固定相への吸着性の差を利用して分ける。

モレキュラーシーブや活性炭などの吸着剤をカラム固定相として用いる。

無機ガスや低級炭化水素類の分離には、固定相としてこれらの吸着剤が使われることが多い。

一般的に固定相に液体を用いた分配クロマトグラフィーの場合、
酸素、窒素、二酸化炭素などの無機ガス
あるいはメタン、エタンなどの低級炭化水素の保持時間は非常に早く、分離が難しい。


分配クロマトグラフィー

液体固定相との分配係数の差を利用して分ける。

移動相と固定相の極性により
順相と逆相に分類

分配クロマトグラフィーでは移動相中の分析対象成分が、カラムの固定相液体に溶入と溶出を繰り返しながら進んでいく。


順相クロマトと逆相クロマト

液クロの歴史は、シリカゲルなどの極性カラム充填剤に吸着した試料成分をヘキサンなどの低極性溶媒で展開することから始まった。

これを順相(normal phase) クロマトという。

やがて液クロの技術が発展して、展開溶媒に水やアルコールなどの高極性溶媒を使用することが多くなった。

これまでと固定相と移動相の極性が逆になったので、これを逆相(reversed phase) クロマトという。

順相分配クロマト

極性固定相(親水性)に非極性移動相(親油性)を流したもの。

親水性の高い分子ほどカラムに保持される。

充填剤

極性の大きいもの(シリカゲルなど)

溶離液

極性の小さいもの(ヘキサン、クロロホルムなど)


逆相分配クロマト

非極性固定相(親油性)に極性移動相(親水性)を流したもの。

親油性の高い分子ほどカラムに保持される。
例)
芳香族化合物
アルキル基の長い物質

充填剤

極性の小さいもの(ODSゲルなど)

溶離液

極性の大きいもの
(水、メタノール、アセトニトリルなどの混合溶媒)


溶出を早める方法

芳香族化合物のような成分がカラムからなかなか出てこないときは、メタノールあるいはアセトニトリルなどの有機溶媒の比率を上げる。

溶出を遅らせる方法

成分がカラムからすぐ出てきてしまう時は、水の比率を上げる。

酸性物質の分離の場合には、pHを下げる。

逆に塩基性物質の場合にはpHを上げる。


サイズ排除クロマトグラフィー

サイズ排除クロマトグラフィー(Size Exclusion Chromatography:SEC)は、試料成分分子の大きさに従った分離を行う方法。

分子ふるい効果と呼ばれる分子次元の細孔をもつ多孔性粒子内への浸透の差を利用して分ける。

分子ふるい

サイズ排除クロマトグラフィーではカラム充填材に微細な穴のある多孔質粒を使用する。

試料中の分子はカラム充填材を通るとき、穴への出入りを繰り返しながら流れる。

サイズの小さい分子ほど穴の奥に入るため遅く出てくる。

サイズの大きい分子ほど穴への出入りが少ないのでカラムから早く出てくる。

こうして試料の分子の大きさにより流出時間が違うことを利用して、分離ができる。

これが分子ふるい。

なお、実際の分子の大きさと分子量の大きさは必ずしも比例しない。

一般にクロマトグラフィーでは、
保持容量(Va)、
固定相の体積(Vs)、
移動相の容積(Vm)
の間には下記の関係式が成り立つ。

Va=Vm+K・Vs

K:分配係数(固定相中における溶質の濃度と移動相中の濃度の比)

SECにおいて排除限界に相当する巨大分子の分配係数は0であり、浸透限界に相当する低分子量の物質の分配係数は1となる。


試料の大きさ(分子量)によって、ゲルを使い分ける。

孔径の大きいゲル

分子量の大きい試料用
例:タンパク質、ポリマー
排除限界分子量が大きい

孔径の小さいゲル

分子量の小さい試料用
排除限界分子量が小さい

排除限界分子量

孔の中に入ることのできない最も小さい分子量のもの。

カラムの排除限界分子量を越えた分子量の成分同士の分離はできない。

GPCとGFC

SECは、
非水系はゲル浸透(GPC)、
水系はゲルろ過(GFC)に分類される。

GPC:溶離液が有機溶媒
GFC:溶離液が水溶液

GPC:Gel Permeation Chromatography

有機溶媒(テトラヒドロフランTHF、クロロホルムなど)を用いる
有機系GPC

GFC:Gel Filtration Chromatography

水溶液を用いる
水系GPC


イオン交換クロマト

イオン交換(ion exchange)クロマトはイオンの引き合う力と反発し合う力を利用して分離を行う方法。

イオン交換クロマトはイオン交換体などを固定相とした分離カラムで試料中のイオン主成分を展開溶離させ、検出する。

移動相:緩衝液

固定相:イオン交換樹脂
ゲルに陽イオンまたは陰イオンの官能基が結合してあるもの。

イオン交換樹脂とは

イオン交換樹脂とは、シリカゲルやポリスチレンなどの粒子にイオン交換基を結合させたもののこと。

検出器の種類

電気伝導度検出器、
電気化学検出器、
吸光光度検出器
蛍光検出器